一、實驗準備

1、健康的HEK 293T細胞，一般使用復蘇后10代以內的細胞進行慢病毒的生產，要求無細菌、真菌以及支原體污染；

2、轉染試劑，如PEI、Higene、lipo2000或lipo3000

各種轉染試劑的步驟稍有差別，小助手以PEI為轉染試劑。

3、DMEM無血清無雙抗培養基、DMEM培養基（10%FBS和1%P/S）；

4、10mL無菌注射器(環氧乙烷滅菌處理)；

5、0.45μm的細菌濾器。

二、包裝步驟

Day1

（7:00 PM）鋪板HEK 293T細胞

數量：400萬/10 cm dish ；覺得計數麻煩的話，可以在293T細胞長到約90%匯合時，1:5傳代（均分成5份），每1份的數目差不多就是400萬了。

Day2

（3:00 PM）三質粒轉染

在培養箱中恢復細胞狀態約20h，此時可進行轉染。三質粒的轉染體系三種質粒的配比有許多種方式，目前MDL使用4:3:1的比例，即PxpAx2：PMD2g：PLVX(載有你基因的質粒)。10cm dish一般轉染質粒的總質量為20μg，PEI的量為質粒的2.5-3倍（也就是50μg-60μg，一般推薦按照2.5倍來）。按照比例算下來，PxpAx2：PMD2g：PLVX的質量比為：(10ug:7.5ug:2.5ug)

注意：在提到質粒的量時，千萬記得說質量而不是濃度，不然容易出錯。

實驗步驟：

取如上總質量為20μg的質粒添加到總體積500μL的DMEM無血清無雙抗培養基中，記為A液，移液槍混勻20次；

取PEI(一般配置成1μg/mL)50-60μg（也就是50-60μL）添加到總體積500μL的DMEM無血清無雙抗培養基中，記為B液，移液槍混勻20次；

將B液逐滴滴加到A液中，移液槍輕柔混勻66次，室溫靜置15-20min；

將靜置好的轉染試劑（A+B）緩緩滴加到恢復狀態20h的HEK 293T細胞中。

做好標記，記好轉染時間、轉染質粒、換液時間等參數提高實驗重復性。

Day3

（9:00 AM）換液

轉染后的第18h，將含有轉染試劑的HEK 293T上清更換為10mL DMEM培養基；對于新手，為了防止在換液時將細胞吹散，可以留3mL的液體在dish中，更換8mL DMEM培養基。

Day4

（3:00 PM）收集病毒液

在轉染后的48-72h，為病毒生產的高峰期，一般我們收集轉染后48h（換液后30h，產毒30h）的病毒液用于實驗，足以滿足大部分實驗需求。收集病毒于15mL tube中，500g，5mL離心去細胞碎片和雜質，隨后使用注射器和濾器進行過濾。收集后的病毒上清可以用來進行感染和儲存。

三、慢病毒滴度測定

病毒滴度的單位為：TU/mL，代表每毫升病毒液中具有轉導功能的病毒顆粒的數目。

計算公式為：滴度=（感染時細胞數（個）*陽性細胞%）/病毒液體積（mL）

病毒液體積和感染時細胞數已知，需通過流式細胞術確認陽性細胞百分比。

滴度測定常常使用HEK 293T細胞，大致的原理為，將在DAY3收集到的病毒上清，按照梯度添加到293T細胞中，感染后48h檢測陽性細胞的比例，從而確定病毒的滴度。

四、注意事項

293T細胞的代數最好用15代以內，最多不超過20代，否則影響轉染效率。質粒濃度在400-1000ng/μL范圍，純度260/280在1.8-2.0之間的轉染效率較高。混合體輕輕滴入細胞上清后搖勻，動作要輕，293T細胞貼壁不牢避免細胞脫落。