仙人掌肉質(zhì)莖中含有多種生物堿, 其中主要為酪胺、N- 甲基酪胺、3- 甲氧基酪胺、β- 苯乙胺、大麥芽堿等酪胺更是仙人掌中生物堿的重要成分。接下來給大家介紹用CO?培養(yǎng)箱從仙人掌里面提取生物堿時所需設(shè)備及實驗方法如下：

實驗對象：HL-60細胞

   提取實驗所需儀器：熒光倒置顯微鏡、凈化工作臺、1640培養(yǎng)基、高速冷凍式離心機、實驗室超純水器、立式壓力蒸汽滅菌器、酶標儀、離心沉淀器、遠紅外干燥箱、恒溫加熱磁力攪拌器、轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、電熱恒溫水浴鍋、循環(huán)水式真空泵、紫外分光光度計、電熱套、圓底燒瓶、蛇形冷凝管、布氏漏斗、分液漏斗、分析天平、容量瓶、量筒、燒杯、膠頭滴管、移液管、比色管。

   實驗試劑：Sigmo MTT試劑、臺盼藍染液、1640培養(yǎng)液、乙醇、甲醇、1 mol / L的硫酸,、濃氨水、改良碘化鉍鉀試劑、酪胺標準溶液、KB r粉末。

方法

    1、仙人掌中生物堿的提取分離與精制將仙人掌粉碎，取細粉20g，在條件為：乙醇濃度95 % 、物料比1∶15 、提取溫度50 ℃、提取時間3 h的條件下，乘熱抽濾，濾渣再于同一條件下提取2h，乘熱抽濾，合并濾液，濾液減壓于水浴鍋中濃縮，再將濾液放冷析出結(jié)晶，得粗提物。向粗提物中加入適量1 mol / L 的硫酸, 形成酸水液和沉淀, 濾去酸水液中的沉淀, 加入適量的濃氨水調(diào)至pH 值9 ～10 。然后用分液漏斗萃取3-4h后,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮后抽濾，得總生物堿。

   2、仙人掌中生物堿類物質(zhì)的鑒定

   化學(xué)法檢查：將提取的總生物堿液，用1%的鹽酸萃取，得鹽酸溶液10毫升，分為四個小試管儲存，分別在四個小試管中加入改良碘化鉍鉀、碘-碘化鉀、硅鎢酸試劑，觀察各試管中的變化。

   薄層層析檢查：取總生物堿少許—丙酮—甲醇（6∶1∶1）溶解, 用毛細管點樣于預(yù)先制備好的硅膠GF254 板上, 上行法展開。當展開劑跑至硅膠板前沿約1～2cm 處時, 取出, 揮干溶劑。先觀察熒光, 后用改良碘化鉍鉀試劑噴霧顯色,觀察斑點位置及顏色，同時用酪胺標準品作對照。

   3、白血病
   HL-60細胞培養(yǎng)人早幼粒白血病細胞HL-60培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，加青霉素100μg·mL-1，鏈霉素100μg·mL-1，置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37℃飽和培養(yǎng)。
   4 、總生物堿的抑瘤實驗準備工作把總生物堿提取物用牛皮紙封好口，離心管與培養(yǎng)瓶放在鋁制盒里，和替補頭一起在壓力蒸汽滅菌器里滅菌，20分鐘后放入遠紅外干燥箱干燥后備用。

   5、接種細胞

   取對數(shù)期生長的HL-60細胞，用離心機1000rmp離心10min后，小心棄去上清液，分別與0.25%胰蛋白酶消化液、0.02%EDTA混合消化后調(diào)節(jié)細胞濃度為1×105 個/ml的單細胞混懸液，每孔150ul接種于96孔培養(yǎng)板中，置5% CO2培養(yǎng)箱中，37℃的培養(yǎng)過夜，備用。

   6、加藥培養(yǎng)
   將提取物制備成10個不同濃度劑量，分別為：5，10，20，50，100，200，400，600，800,1000ug/ml。

   7、再將不同濃度的提取物

50ul分別加入各接種了HL-60細胞的試驗孔中，平行5孔

   8、設(shè)置只加細胞，

不加藥液的對照孔和只加培養(yǎng)液的空白孔,均平行5孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h

   9、熒光倒置顯微鏡觀察法測定
在加藥培養(yǎng)前和加藥培養(yǎng)后的24、48、72h于熒光倒置顯微鏡下觀察實驗組與空白組不同時期細胞的生長狀態(tài)及細胞形態(tài)。
   10、MTT法檢測
取處于指數(shù)生長期的HL-60細胞，用離心機1000rmp離心10min后，小心棄去上清液，分別與0.25%胰蛋白酶消化液、0.02%EDTA混合消化后調(diào)節(jié)細胞濃度為1×104個/ml的單細胞混懸液，每孔150ul接種于96孔培養(yǎng)板中，并設(shè)空白對照孔，只加培養(yǎng)液，不加細胞，置5% CO2，37℃的CO2培養(yǎng)箱中過夜。
   11、換液，加入受試藥物，50μl/ 孔，每個濃度設(shè)5 個重復(fù)，細胞在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 8 h 后，加入MTT20μl/ 孔(5mg/ml)，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中、置5% CO2 反應(yīng)4h。
   12、小心吸去上清液，加入DMSO 溶解，每孔150μl,平板搖床上振搖5min。用酶標儀在波長為570nm 處測定每孔的OD值，測時須減去空白對照，實驗重復(fù)三次。
   13、計算細胞存活率及藥物對細胞的抑制率。
細胞存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100% 細胞抑制率(%)= （1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%

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